富含半胱氨酸型酸性蛋白在高脂饮食诱导的肥胖相关胰岛素抵抗大鼠脂肪组织中的表达及意义

发表时间:2018/4/8   来源:《心理医生》2018年8期   作者:沈扬1 赵玉岩2
[导读] 富含半胱氨酸型酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)最早由Termine[1]等人于1981年鉴定出为骨的一种非胶原成分。

(1宁夏医科大学总医院内分泌科  宁夏银川  750004)
  (2中国医科大学第一附属医院内分泌科  辽宁沈阳  110001)
  【摘要】目的:观察富含半胱氨酸型酸性蛋白在高脂饮食诱导的肥胖相关胰岛素抵抗大鼠脂肪组织中的表达及意义。方法:选出30只体重为140~180g的Sprague-Dawley雄性大鼠,随机分为正常对照组、高脂饮食组。正常对照组进食普通饲料,高脂组予以膳食配方。8周后进行钳夹技术检测其相关指标。结果:喂养8周后,高脂肪膳食组大鼠GIR60-120较对照组降低48%(P<0.01),即机体出现严重的IR。体重(BW)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素水平(FIns)高于对照组,分别为45%、14%、17%(P<0.05);胰岛素敏感指数(ISI)较对照组低27%(P<0.05);免疫组化分析发现在高脂肪膳食诱导的IR大鼠脂肪组织中,SPARC表达的阳性细胞数较对照组增加;Western印迹杂交和荧光实时定量PCR分析进一步证实,高脂组大鼠脂肪组织SPARC蛋白表达量较对照组升高75%,mRNA表达较对照组升高84%。结论:SPARC可能参与高脂饮食诱导的肥胖相关胰岛素抵抗的发生发展。
  【中图分类号】R151                    【文献标识码】A                     【文章编号】1007-8231(2018)08-0176-03
  富含半胱氨酸型酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)最早由Termine[1]等人于1981年鉴定出为骨的一种非胶原成分,是一种富含半胱氨酸的小分子糖蛋白,又称作骨连结蛋白(osteonecfin)。SPARC主要来源于脂肪细胞,有抗细胞粘附,调节细胞增殖,调节组织分化和胚胎发育的作用[2,3]。IR是指胰岛素作用的靶组织(如肝脏、骨骼肌和脂肪组织等)对正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种病理生理状态,即靶组织对胰岛素作用的敏感性降低[4]。而胰岛素抵抗又是肥胖与2型糖尿病发生发展关系的中心环节(Kahn et al.,2006[5];Ferrannini et al.,2007[6];Qatanani andLazar, 2007[7]).我们拟研究在高脂肪膳食诱导的胰岛素抵抗大鼠模型中SPARC的表达,以期为肥胖导致的IR治疗提供理论基础。
  1.材料与方法
  1.1 高脂饮食诱导胰岛素抵抗大鼠模型的建立
  30只体重为140~180g的Sprague-Dawley雄性大鼠(购于中国医科大学动物实验中心),随机分为正常对照组、高脂饮食组。正常对照组进食普通饲料,高脂组膳食配方参考文献[8]。8周后进行钳夹技术检测其相关指标的测定。
  1.2 钳夹技术评价
  每组大鼠随机抽取5只,4%水合氯醛腹腔内麻醉后行1.67 mU/(kg·min)胰岛素输注,血糖值超过基础值±0.5mmol/L开始葡萄糖输注。每5min 监测1次血糖并调节葡萄糖输注率(GIR),维持血糖在基础值±0.5mmol/L的平台,即“钳夹形成”。全部实验共持续120min,将60min到120min的13个GIR求均值,即GIR60~120作为反映体内胰岛素敏感性的指标(GIR60~120越低IR越严重)[9,10]。
  1.3 胰岛素和血糖的检测
  各组剩余动物禁食12小时,测体重,心脏穿刺取血,血糖仪测定血糖。其余血样分离血清,测定血清胰岛素水平采用竞争性放射免疫分析方法测定。试剂盒购自Benkman Coulter公司,美国,操作按试剂盒说明书进行。
  1.4 免疫组化
  脂肪组织样本固定于10%甲醛过夜。将标本蜡块切成5μm的薄片,经过脱蜡,水化,抗原修复后,于3%过氧化氢孵育,再于10%山羊血清室温孵育后,将1:100稀释的一抗SPARC湿盒内孵育4℃过夜。二抗于37℃孵育30分钟。后滴加HRP标记亲和素,37℃孵育30分钟。DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片,镜检,于400×镜下拍照。
  1.5 实时荧光定量PCR
  利用总RNA提取试剂盒(天根)提取脂肪组织总RNA。1μg总RNA利用TIANScript RT Kit(TIANScript cDNA第一链合成试剂盒)反转录得到cDNA。稀释引物至10μM,引物序列为SPARC上游引物:GGGCAGACCAATACCTCACTA,下游引物:CCGACCATTCCTTCCGTTG;β-actin上游引物:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC;下游引物:GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT;反应中使用的DNA染料为带有荧光染料的PCR反应预混合物SYBR GREEN mastermix,反应条件为95℃10min,95℃10s,60℃20s,72℃30s,反应40个循环。所得结果的Ct值(cycle threshold)为达到超出荧光信号的检测阈值时所需的循环数。所得数据用2-△△Ct方法来计。(Livak and Schmittgen,2001)。
  1.6 组织总蛋白质提取及Western印迹杂交
  组织裂解液裂解脂肪组织,取上清,测定总蛋白含量。已溶解于加样缓冲液的总蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,70V电泳转移至硝酸纤维膜上,脱脂奶粉封闭液封闭2h,用1:1000稀释SPARC抗体(鼠抗鼠多克隆抗体 Sigma公司)进行Western蛋白印迹杂交,40℃孵育过夜。1:5000稀释的Ⅱ抗(羊抗鼠IgG-HRP Sigma公司)孵育2h,采用DAB显色试剂盒显影并检测。以β-actin作为内对照。
  1.7 统计学处理
  应用SPSS16.0统计软件,数据用均数±标准差(x-±s)表示,两组间计量资料均数比较用t检验。 
  2.结果
  2.1 IR大鼠模型中血糖和胰岛素的改变
  喂养8周后,高脂肪膳食组大鼠GIR60-120较对照组降低48%(P<0.01),即机体出现严重的IR。同时体重(BW)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素水平(FIns)高于对照组,分别为45%、14%、17%(★P<0.05);胰岛素敏感指数(ISI)较对照组较低27%(★P<0.05)。见表1。
  
  2.2 高脂肪膳食诱导对IR大鼠脂肪组织SPARC表达的影响
  免疫组化分析发现在高脂肪膳食诱导的IR大鼠脂肪组织中,SPARC表达的阳性细胞数较对照组增加(图A);Western印迹杂交(图B)和荧光实时定量PCR(图C)分析进一步证实,高脂组大鼠脂肪组织SPARC 蛋白表达量较对照组升高75%,mRNA表达较对照组升高84%。见表2。
  
  3.讨论
  本实验以高脂饮食喂养的方式建立大鼠胰岛素动物模型,通过目前公认的高血浆胰岛素一正常血糖钳夹技术对其进行检测。
  其原理是:输注胰岛素以维持血中胰岛素在一个高水平线上,由于输注的高水平胰岛素使机体血糖不断代谢,要维持血糖在原来的基础水平上,需不断输注葡萄糖。当葡萄糖输注率和代谢速率达到平衡时,葡萄糖输注速率就等于体内各组织摄取葡萄糖的速率,所以钳夹技术的GIR值反映了组织对外源性胰岛素的敏感性,它可以从总体上评价机体对胰岛素的反应性。本钳夹实验发现高脂饮食喂养大鼠8周后,高脂组的GIR60-120明显低于对照组(P<0.01),胰岛素敏感性(ISI)亦较对照组降低(P<0.05),表明高脂肪膳食喂养可诱导产生IR大鼠模型。目前有研究表明,肥胖可以导致IR,肥胖者存在高胰岛素血症[11,12]。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)也被称为BM-40 和骨连接素,皮下脂肪细胞是SPARC的主要来源。本实验免疫组化结果显示高脂组大鼠脂肪组织SPARC表达的阳性细胞数较对照组增加(如图A所示),进一步利用western blot及荧光实时定量PCR进行定量分析,结果表明高脂组大鼠脂肪组织SPARC 蛋白表达量及mRNA表达较对照组显著升高(P<0.01)(如表2所示),提示SPARC与肥胖及胰岛素抵抗密切相关。其作用机制可能是:一方面SPARC在脂肪细胞分化、脂肪形成、脂肪组织增生中有一定作用[13]。SPARC可促进非溶解性胶原蛋白在脂肪组织的沉积,促进脂肪组织的纤维化过程,皮下脂肪的纤维化可能限制了三酰甘油在皮下脂肪的沉积,故三酰甘油转化并异位沉积于非脂肪组织,如肝和肌肉等,促发或促进了胰岛素抵抗[14,15]。有研究表明肥胖者的脂肪组织易纤维化[16]。另一方面SPARC作为细胞外基质(ECM)调节因子,促进脂肪组织EMC胶原蛋白VIalpha3 水平增加,影响糖及胰岛素代谢失衡,导致高胰岛素血症,进而促进胰岛素抵抗的发生[17]。有研究发现SPARC表达与甘油三脂水平呈正相关,而与脂联素呈负相关,提示SPARC参与脂质的代谢紊乱及与其介导的胰岛素抵抗密切相关[18]。另外,SPARC还可抑制高脂饮食诱导的ERK1/2磷酸化[19],表明SPARC可能通过抑制ERK信号通路从而参与促进胰岛素抵抗。Esposito等研究发现SPARC过表达可以减少IL-10的产生,而IL-10可抑制炎症反应并增加胰岛素的敏感性,故SPARC通过抑制IL-10促进炎症发挥胰岛素抵抗的效应[20]。综上所述,SPARC可能参与高脂饮食诱导的肥胖相关胰岛素抵抗的发生发展。
  
  【参考文献】
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