姜黄素联合硼替佐米对前列腺癌细胞的抑制作用

发表时间:2018/5/7   来源:《航空军医》2018年4期   作者:王厚清1 王理军1 刘修恒
[导读] 探讨姜黄素(curcumin)联合硼替佐米(bortezomib)对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响。

(1监利县第二人民医院泌尿外科  433325;2武汉大学人民医院泌尿外科  430060)
摘要:目的 探讨姜黄素(curcumin)联合硼替佐米(bortezomib)对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 CCK-8法测定姜黄素、硼替佐米及姜黄素联合硼替佐米作用于PC-3细胞后的细胞生存率,流式细胞技术测定细胞周期及凋亡率,免疫印迹检测凋亡蛋白caspase 3表达水平。结果 与对照组比较,姜黄素联合硼替佐米组能显著抑制PC-3细胞增殖(P<0.05),呈时间依赖性,阻滞PC-3细胞于G2/M期比例明显增多(P<0.05)。联合应用姜黄素和硼替佐米处理的PC-3细胞凋亡率较对照组高(P<0.05),凋亡蛋白caspase-3表达水平也较对照组增强。结论 姜黄素联合硼替佐米可明显增强对PC-3细胞增殖的抑制和诱导凋亡作用,凋亡作用可能与其上调caspase 3表达有关。
关键词:前列腺癌;姜黄素;硼替佐米;细胞凋亡

 
        前列腺癌是一种发生于老年男性的常见肿瘤,大多数患者就诊时已属晚期,失去手术根治机会,内分泌治疗虽有效,但约2-3年后会出现去势抵抗,伴随化疗方案的改进,治疗效果虽有所提高,但患者的预后仍然较差。硼替佐米是一种新型蛋白酶体抑制剂,主要用于治疗多发性骨髓瘤[1],但近年来发现其对前列腺癌等实体瘤也有一定的疗效[2]。姜黄素是从中药姜黄中提取的活性成分,具有广泛的药理作用,如抗炎、抗氧化、抑制血管生成及特有的抗肿瘤活性[3]。因此,我们尝试探索姜黄素协同硼替佐米对前列腺癌细胞的作用,以获取更好的抗癌效果。
        1 材料与方法
        1.1 材料
        人前列腺癌细胞PC3购自中国科学院细胞典藏中心。硼替佐米购自西安杨森制药公司,姜黄素、CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所,Annexin V凋亡试剂盒购自联科生物科技有限公司,胎牛血清、RPMI1640培养液购自杭州四季青公司,兔抗人Caspase-3多抗购自Santa cruze公司,羊抗兔IgG二抗购自博士德公司。
        1.2 方法
        1.2.1 细胞培养
        人前列腺癌细胞PC3在10%胎牛血清的RPMI1640培养液,37℃,5%CO2的培养箱中培养。
        1.2.2 CCK-8法测定PC-3细胞增殖活性
        取对数期生长的PC3细胞2×104/孔接种于96孔圆底培养板,每孔添加100μl培养基,培养18h后分别加入硼替佐米(1.6 μmol/L)、姜黄素(50μml/L)及硼替佐米(1.6 μmol/L)+姜黄素(50μml/L)继续培养,每组设3个复孔,并设阴性对照组(不加化疗药物)。在培养24、48、72h各时间点,分别加入10ul/孔CCk-8溶液,再经2h培养后,酶标仪于450nm处测其吸光度(A)值。
        1.2.3流式细胞仪检测PC-3细胞周期及凋亡率
        取对数期生长的PC-3细胞5×104/孔接种于12孔圆底培养板,每孔添加2ml培养基,培养18h后,分别加入硼替佐米、姜黄素、硼替佐米+姜黄素,浓度同前。培养24h后收集细胞,PBS冲洗后用结合缓冲液悬浮细胞,调整细胞数至1×106,取100μl细胞悬液加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI混匀后避光15min,流式细胞仪检测细胞凋亡率。收集的细胞经PBS液洗涤2次后,加入预冷的70%乙醇固定细胞4℃过夜,用0.15ml的PI综合染液(含50g/L RNA酶)避光染色30min后,采用流式细胞仪检测。



        1.2.4 Western blot检测
        细胞给药处理后24h,提取细胞总蛋白,取40μg蛋白进行10%SDS-PAGE凝胶电泳,电泳结束后转移蛋白至 NC膜上,5%脱脂奶粉4℃封闭过夜,TBST洗3次;室温分别加入1:2000兔多克隆抗Caspase-3孵育2h,TBST洗膜3次,加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶结合的羊抗兔 IgG,室温孵育2 h,TBST洗膜3次,ECL法显色。
        1.2.5 统计学处理
        采用SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析,数据以 ± s表示
        2 结  果
        2.1 姜黄素联合硼替佐米对PC-3细胞增殖活性的影响
        通过CCK-8比色法检测姜黄素联合硼替佐米对前列腺癌细胞PC-3的抑制作用,可见姜黄素与硼替佐米一样,作用后24、48、72h,对PC-3细胞有一定杀伤作用,即细胞生存率明显减低(P<0.05),而联合用药较单独用药的抑制作用更明显(P<0.05),且姜黄素联合硼替佐米的作用呈时间效应关系,72h较48h、48h较24h的抑制作用更大(P<0.05)。
        2.2 姜黄素联合硼替佐米对PC-3细胞周期的影响
        流式细胞仪结果显示,姜黄素联合硼替佐米作用组处于G2/M期细胞比例明显增多(P<0.05),而处于G0/G1期细胞比例无明显(P>0.05),表明存在G2/M期阻滞。
        2.3 姜黄素联合硼替佐米对PC-3细胞凋亡的影响
        姜黄素联合硼替佐米对前列腺癌细胞PC-3作用24h后通过FCM检测,联合用药较导致细胞凋亡率达(29.98±1.04)%,硼替佐米组(20.69±1.01)%、姜黄素组(21.65±1.03)%及对照组(4.67±0.18)%明显,差异有统计学意义(P<0.05)。
        2.4 caspase-3表达检测
        Western blot 检测各组PC-3细胞中的caspase-3的表达量,结果可见在姜黄素、硼替佐米分别作用下,PC-3细胞表达caspase-3量较对照组升高,而联合用药较单独用药引起的caspase-3表达增加更明显。
        3 讨  论
        本研究中,当联合姜黄素与硼替佐米处理PC-3细胞时,PC-3细胞的生长抑制率和凋亡诱导率较单独用药更明显,结果表明联合用药对前列腺癌细胞的抑制作用加强。本研究说明姜黄素可以增加硼替佐米对前列腺癌细胞的敏感性,同时增强硼替佐米诱导肿瘤细胞凋亡的作用。在姜黄素的协同做用下,硼替佐米的抑制肿瘤作用明显增强,为探讨其机制,我们检测了caspase-3的表达水平。Caspase家族是细胞凋亡发生和调控机制中的重要因素,而caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路,也是凋亡的关键酶和执行者。基因敲除实验和动物模型也显示,抑制caspase-3活性将显著阻滞体外和体内的细胞凋亡。研究中发现给药组与对照组相比,各给药组caspase-3表达上调,联合给药组表达量上调更明显,说明PC-3细胞的凋亡抑制可能是caspase-3上调所导致。综上所述,姜黄素联合硼替佐米能得到较好的前列腺癌治疗效果,为探讨前列腺癌新的药物治疗奠下实验基础。
参考文献
[1]Ocio EM,Mateos MV,Maiso P,et al. New drugs in multiple yeloma:mechanisms of action and phase I/Ⅱ clinical findings. Lancet Oncol 2008;9:1157-1165
[2]Ryan DP,O’Nei BH,Supko JG. Aphase I study of bortezomib plus irinotecan in patients with advanced solid tumors. Cancer 2006;107:2688-2697
[3]Hasima N,Aggarwal BB. Cancer-linked targets modulated by curcumin. Int J Biochem Mol Biol. 2012;3(4):328-51

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